Antibiotik adalah obat yang digunakan untuk mencegah dan mengobati infeksi bakteri. Pengetahuan yang kurang dapat membentuk perilaku yang salah dalam menggunakan antibiotik. Tujuan dari penelitian ini untuk mengevaluasi pengetahuan dan perilaku penggunaan antibiotik serta menganalisis perbedaan rata-rata pengetahuan  mahasiswa yang mempelajari ilmu kesehatan dan  yang tidak mempelajari ilmu kesehatan. Penelitian ini menggunakan metode cross sectional dan bersifat observasional yang dilakukan dengan cara membagikan kuesioner online  dan hasil penelitian dipaparkan secara deskriptif. Metode pengambilan sampel menggunakan metode convenience random sampling. Penelitian dilakukan terhadap 115 mahasiswa Fakultas MIPA ULM. Hasil penelitian menunjukkan jumlah responden mahasiswa kesehatan sebanyak 46 orang dan mahasiswa non kesehatan sebanyak 69 orang. Kesimpulan penelitian ini yaitu rata-rata pengetahuan mahasiswa kesehatan sebesar 11,59 dengan nilai standar deviasinya 1,499 dan mahasiswa non kesehatan sebesar 7,43 dengan nilai standar deviasi 2,752, perilaku mahasiswa kesehatan dan non kesehatan mayoritas menunjukkan perilaku yang positif terhadap penggunaan antibiotik serta terdapat perbedaan rerata pengetahuan yang bermaknaantara mahasiswa yang mempelajari ilmu kesehatan dan yang tidak mempelajari ilmu kesehatan dengan nilai p 0,000.

Kata Kunci: Antibiotik, Pengetahuan, Perilaku, Mahasiswa Kesehatan, Mahasiswa Non Kesehatan.