Tulang sotong mengandung metabolit sekunder yang terdiri dari alkaloid, steroid, triterpenoid, tanin, dan glikosida yang berpotensi sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis aktivitas ekstrak tepung tulang sotong terhadap E. coli. Tahapan penelitian meliputi penghalusan tulang sotong menjadi tepung, ekstraksi tepung tulang sotong secara maserasi dengan pelarut n-heksana, etil asetat, dan etanol, serta pengujian aktivitas antibakteri ekstrak tepung tulang sotong menggunakan metode kontak langsung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 155 g tulang sotong diperoleh 85 g tepung tulang sotong yang berwarna agak kekuningan. Ekstrak n-heksana tepung tulang sotong berwarna putih susu dengan konsistensi cair dan berminyak, ekstrak etil asetat berwarna bening dengan konsistensi cair dan berminyak, dan ekstrak etanol berwarna bening dengan konsistensi cair dan tidak berminyak. Rendemen masing-masing ekstrak dari ekstrak n-heksana, etil asetat dan etanol adalah sebagai berikut: 1,09%. 5,42%, 9,5%. Ekstrak etil asetat tepung tulang sotong pada konsentrasi 100 µl/ml mampu menghambat E.coli sebesar 75%.