Tumbuhan pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack.) memiliki berbagai macam kandungan senyawa metabolit sekunder yang memiliki khasiat sebagai antidiabetes salah satunya flavonoid. Kandungan senyawa flavonoid paling banyak ditemukan pada bagian akar. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antidiabetes dari ekstrak etanol akar E. Longifolia Jack. secara in vitro. Metode penelitian ini diawali dengan membuat ekstrak etanol akar E. Longifolia Jack. menggunakan metode perkolasi yang dilanjutkan dengan pengujian aktivitas antidiabetes. Uji aktivitas antidiabetes yang digunakan uji serapan glukosa oleh sel ragi yang diawali dengan pembacaan panjang gelombang maksimum dan operating time menggunakan  spektrofotometer UV-Vis. Hasil dari uji serapan glukosa oleh sel ragi dengan larutan pembanding dan ekstrak etanol akar E. Longifolia Jack. menggunakan glukosa 5%, 10%, 15%, 20% dan 25% diperoleh nilai IC₅₀. Berdasarkan nilai IC₅₀ pada larutan metformin menggunakan larutan glukosa 20% memiliki aktivitas antidiabetes yang paling kuat dengan nilai IC₅₀ 146,508 ppm, pada larutan ekstrak etanol akar E. longifolia Jack menggunakan larutan glukosa 25% memiliki aktivitas antidiabetes yang terkuat dengan nilai IC₅₀ 74,564 ppm. Hasil analisis kualitatif berdasarkan nilai IC₅₀ antar kelompok menggunakan IBM SPSS menunjukkan pada kelompok ekstrak E. longifolia menggunakan glukosa 5% dan 20% tidak memiliki perbedaan yang signifikan, sedangkan antar kelompok yang lainnya memiliki perbedaan yang signifikan.