Keterampilan berpikir kritis merupakan salah satu kompetensi utama di abad 21. Namun, ketiadaan handout berbasis keterampilan berpikir kritis menjadikan peserta didik kurang menguasai keterampilan tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan handout biologi yang layak digunakan untuk melatihkan keterampilan berpikir kritis peserta didik pada konsep sistem peredaran darah manusia. Penelitian ini merupakan penelitian dan pengembangan dengan model 4D (Define, Design, Develop, Disseminate). Subjek uji validasi melibatkan 3 pakar, uji keterbacaan isi (5 peserta didik), uji coba terbatas (6 peserta didik), dan uji coba luas (18 peserta didik). Teknik pengumpulan data menggunakan instrumen validasi handout, penilaian keterbacaan, angket respon, dan tes keterampilan berpikir kritis. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif kualitatif dan kuantitatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa handout biologi yang dikembangkan secara sistematis sampai tahap develop memenuhi kriteria valid secara isi (nilai 4,3) dan konstruk (nilai 4,4), nilai keterbacaan isi sebesar 92,65 dengan kriteria sangat baik, respon peserta didik pada uji coba terbatas dan luas masing-masing 89,6 dan 87,4 dengan kriteria sangat baik. Selain itu, perolehan nilai n-gain berpikir kritis pada uji terbatas dan luas masing-masing sebesar 0,8 dan 0,9 dengan kriteria peningkatannya adalah tinggi. Diperoleh simpulan bahwa handout biologi yang dikembangkan adalah layak digunakan untuk melatihkan keterampilan berpikir kritis peserta didik pada konsep sistem peredaran darah manusia.