Vaksin merupakan teknologi pengendalian penyakit ikan yang efisien, efektif, dan ramah lingkungan. Pemberian vaksin heat killed A. hydrophila adalah salah satu upaya dalam pencegahan dan pengendalian serangan penyakit Motile aeromonad septicemia (MAS). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh vaksin heat killed terhadap tingkat perlindungan relatif, rerata waktu kematian serta mengetahui dosis optimal untuk vaksinasi. Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan 3 ulangan. Parameter yang diamati meliputi tingkat perlindungan relatif, sintasan, mortalitas, rerata waktu kematian, gejala klinis, dan kualitas air. Hasil penelitian menunjukkan pemberian vaksin dengan variasi dosis yang berbeda berpengaruh nyata terhadap parameter tingkat perlindungan relatif, sintasan, mortalitas dan rerata waktu kematian, serta memberikan perlindungan dengan meminimalisir gejala klinis ketika dilakukan uji tantang A. hydrophila. Kualitas air masih dalam kisaran normal untuk kehidupan dan vaksinasi ikan papuyu. Dosis vaksin heat killed A. hydrophila yang tertinggi terdapat pada perlakuan dosis 10⁷ sel/ml.