Infeksi oleh bakteri Escherichia coli (E. coli) sering terjadi melalui kulit tangan. Pencegahan penularannya dapat menggunakan antiseptik seperti gel hand sanitizer berbahan alkohol 70%. Penggunaan alkohol dalam jangka waktu panjang dapat menyebabkan dampak negatif sehingga diperlukan pencarian antiseptik alternatif berbahan alami. Pada daun Piper betle (P. betle) dan Citrus hystrix (C. hystrix) terkandung senyawa bioaktif bersifat antibakteri dan berpotensi sebagai antiseptik. Tujuan penelitian ini membandingkan efektivitas hand sanitizer kombinasi infus P. betle dan C. hystrix (Pb+Ch) dengan hand sanitizer alkohol 70% (KP) ditinjau dari jumlah koloni E. coli. Penelitian eksperimental ini menggunakan rancangan posttest only with control group design dengan metode perhitungan jumlah koloni menggunakan metode pour plate. Jumlah koloni E. coli pada perlakuan kombinasi infus Pb+Ch (6,25%, 12,5%, 25%, 37,5% dan 50%) dan KP pada 4 kali pengulangan, didapatkan hasil berbeda bermakna (p>0.05). Jumlah koloni E. coli makin sedikit dipengaruhi oleh peningkatan konsentrasi infus Pb+Ch. Efek yang paling baik dihasilkan oleh Pb+Ch 50%. Kesimpulan, terdapat perbedaan efektivitas antara gel hand sanitizer berbahan kombinasi infus P. betle dan C. hystrix dibandingkan dengan berbahan alkohol 70% terhadap jumlah koloni E. coli.