Rizosfer merupakan daerah di sekitar perakaran tanaman yang menjadi dasar ideal bagi hidupnya mikroba tanah. Pengembangan penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman koloni jamur mikroskopis pada tanah serta untuk mengetahui validitas, keterbacaan dan respon mahasiswa terhadap E-Handout keragaman koloni jamur mikroskopis pada rizosfer tanaman Citrus nobilis di Agrowisata Desa Karang Bunga Kabupaten Barito Kuala. Hasil keragaman koloni jamur yang didapatkan kemudian diidentifikasi berdasarkan literatur mengenai sifat-sifat koloni jamur mikroskopis dan dikembangkan menjadi bahan ajar berbentuk E-Handout sebagai bahan pengayaan mata kuliah Mikrobiologi. Pengembangan E-Handout dilakukan dengan model ADDIE sampai pada tahap development (pengembangan). Penelitian ini dilakukan dengan pendekatan deskriptif dengan pengambilan sampel tanah pada 2 galangan yang masing-masing diambil 3 titik. Subjek pada uji validasi dilakukan oleh 3 orang validator, uji keterbacaan dilakukan oleh 9 mahasiswa dan uji respon mahasiswa dilakukan oleh 9 orang mahasiswa dari Program Studi Pendidikan Biologi PMIPA FKIP ULM Banjarmasin yang telah lulus mata kuliah Mikrobiologi. Berdasarkan hasil penelitian ditemukan 8 jenis koloni jamur mikroskopis yang tumbuh pada medium dengan hasil identifikasi dari morfologi masing-masing koloni yang terlihat. Pada uji validasi materi E-Handout yang dikembangkan memperoleh persentase 88,46% (sangat valid) dan validasi materi 100% (sangat valid). Pada uji keterbacaan dengan persentase 89,13% (sangat baik). Pada uji respon mahasiswa memperoleh persentase 86,78 (sangat baik).