Tanah gambut merupakan lingkungan yang potensial bagi tumbuhnya bakteri lokal dengan aktivitas selulolitik. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri selulolitik asal tanah gambut. Sampel tanah gambut diambil dari Desa Puntik Luar Kabupaten Barito Kuala. Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan menggunakan media selektif CMC dengan metode spread plate. Ekstrak kasar enzim selulase dari isolat bakteri dikarakterisasi untuk menentukan suhu dan pH optimum. Pengaruh suhu dan pH selalu dijadikan parameter yang sangat penting dalam menentukan aktivitas enzim selulase. Hasil penelitian menunjukkan ada 5 isolat bakteri yang memiliki aktivitas selulolitik yaitu isolat dengan kode J1, J5, J6, J7, dan J8. Isolat yang memiliki indeks selulolitik tertinggi yaitu J1 = 4 dan J7 = 2. Isolat J1 memiliki aktivitas tertinggi pada suhu 45 °C dan pada pH 7 serta isolat J7 pada suhu 50 °C dan pada pH 4. Kesimpulan dari penelitian ini menunjukkan bahwa Isolat J1 dan J7 memiliki aktivitas selulolitik tertinggi dibandingkan dengan 3 isolat lainnya yang ditemukan di tanah gambut Desa Puntik Luar Kabupaten Barito Kuala.