Ekstrak etanol daun Pandanus odorifer diketahui mengandung metabolit sekunder seperti steroid, terpenoid, fenolik, dan flavonoid sehingga diduga akan memiliki aktivitas antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar flavonoid total dan menentukan aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun P. odorifer terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Ekstraksi daun P. odorifer dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Penentuan kadar flavonoid total menggunakan kuersetin sebagai baku pembanding. Pengujian antibakteri menggunakan metode difusi kertas cakram dengan konsentrasi ekstrak 50%, 40%, dan 30%. Kontrol positif yang digunakan merupakan kloramfenikol dan kontrol negatifnya aquadest steril. Penentuan KHM dan KBM menggunakan metode dilusi. Rata-rata kadar flavonoid total ekstrak etanol daun P. odorifer sebesar 100,0982±0,007290148 mg/g ekivalen kuersetin atau setara dengan 10,0098%±0.000007290 b/b ekivalen kuersetin. Aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun P. odorifer terhadap bakteri E. coli memiliki rentang diameter zona hambat 8,150–23,167. sedangkan pada aktivitas antibakteri terhadap S. aureus rentang diameter zona hambatnya 10,150–25,367. Konsentrasi ekstrak etanol daun p. odorifer 50% tergolong ke dalam kategori sangat kuat dalam menghambat bakteri E. coli dan S. aureus. Nilai KHM ekstrak etanol daun P. odorifer terhadap E. coli yaitu pada konsentrasi 15%, sedangkan pada bakteri S. aureus pada konsentrasi 7,5%. Nilai KBM terhadap bakteri E. coli pada konsentrasi 15%, sedangkan pada S. aureus belum dapat ditetapkan. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun P. odorifer memiliki aktivitas antibakteri yang bersifat bakteriostatik terhadap bakteri S. aureus dan bakteriosida terhadap bakteri E. coli.