Penelitian ini bertujuan untuk menguji madu-kuning telur sebagai pengencer alternatif semen sapi Limousin. Penelitian dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat perlakuan dan enam kali ulangan. Perlakuan penelitian dengan menggunakan pengencer yang dikelompokkan menjadi beberapa tingkat konsentrasi yaitu Laktosa + Kuning Telur dengan perbandingan 80:20 (P0), Madu + Aquabidestilata + Kuning Telur dengan perbandingan 3:77:20 (P1), Madu + Aquabidestilata + Kuning Telur dengan perbandingan 4:76:20 (P2), Madu + Aquabidestilata + Kuning Telur dengan perbandingan 5:75:20 (P3). Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Perlakuan yang menunjukkan pengaruh nyata, dilanjutkan dengan uji beda nilai tengah menggunakan uji Beda Nyata Terkecil (BNT). Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan hasil preservasi menggunakan Laktosa + Kuning Telur dibandingkan Madu + Aquabidestilata + Kuning Telur terhadap persentase hidup dan motilitas spermatozoa sapi Limousin. Madu dapat dimanfaatkan sebagai sumber energi dalam bahan pengencer alternatif yang dapat mempertahankan kualitas semen sapi Limousin selama preservasi dan mampu menjadi pengganti bahan pengencer kimiawi sintetik.