Eurycoma longifolia Jack. umumnya dikenal sebagai ‘pasak bumi’ dari famili Simaroubaceae yang diketahui mengandung senyawa golongan fenolik yang memiliki aktivitas diantaranya seperti antioksidan, peningkat imunitas, antikanker dan afrodisiaka. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar fenol total fraksi etil asetat akar E. longifolia yang ditentukan dengan metode spektrofotometri UV-Vis dan menetapkan kemampuan fraksi etil asetat akar E. longifolia sebagai antioksidan berdasarkan nilai Inhibitor Concentration 50 (IC₅₀). Selain itu, penelitian ini bertujuan untuk menetapkan karakteristik gugus fungsi dari  fraksi etil asetat akar E. longifolia menggunakan metode spektrofotometri FTIR. Penetapan kadar fenol total dilakukan dengan metode spektrofotometri UV-Vis berdasarkan metode Folin-Ciocalteu dengan standar asam galat. Aktivitas antioksidan ditentukan dengan metode DPPH (2,2-difenil-2-pikrilhidrazil) dan kuersetin sebagai pembanding. Hasil kadar fenol total fraksi etil asetat akar E. longifolia sebesar 15,211 ± 0,031 % (b/b) ekivalen asam galat. Fraksi etil asetat akar E. longifolia menunjukkan aktivitas antioksidan yang aktif dengan nilai IC₅₀ sebesar 95,5 ppm. Hasil analisis karakteristik gugus fungsional senyawa aktif yang terdapat pada fraksi etil asetat akar E. longifolia menggunakan metode spektrofotometri FTIR diperoleh puncak serapan yang menunjukkan adanya gugus O-H (3420 cm^-1), C-O (1098 cm^-1), C=O (1734 cm^-1), C=C (1651 cm^-1) , C-H ulur (2927 cm^-1) dan C-H tekuk (1511 cm^-1, 1459 cm^-1, 1380 cm^-1 dan 800 cm^-1). Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat akar E. longifolia memiliki kandungan senyawa fenol dan berpotensi sebagai antioksidan yang kuat.