Fitosterol merupakan senyawa steroid alkohol yang ada secara alami di dalam tumbuhan dan tidak ditemukan pada mamalia. Fitosterol mampu mengurangi kadar kolesterol total dan LDL kolesterol di dalam darah, serta diduga memiliki aktivitas sebagai afrodisiak dan meningkatkan kesuburan hewan uji. Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis perbedaan kadar fitosterol ekstrak petroleum eter daging buah durian Sipenyangat, Simandam, Sibalau, dan Sisanggan.Metode penelitian ini yaitu identifikasi fitosterol dengan metode skrining fitokimia dan kromatografi lapis tipis, penetapan kadar fitosterol menggunakan spektrofotometri UV-Vis dengan standar stigmasterol, serta analisis perbedaan kadar fitosterol dengan metode SPSS. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak petroleum eter daging buah D. zibethinus Murr. mengandung senyawa fitosterol berdasarkan hasil skrining fitokimia yang menunjukkan perubahan warna biru kehijauan, dan hasil KLT yang menunjukkan bercak sampel yang sejajar dengan standar dengan nilai Rf = 0,46 untuk sampel dan 0,5 untuk standar.Ekstrak petroleum eter daging buah D. zibethinus Murr. mengandung fitosterol sebesar 1,4234±0,009 % b/b Ekuivalen Stigmasterol (ES) untuk varietas Sipenyangat; 1,3093±0,009 % b/b ES untuk Simandam; 1,3867±0,007 % b/b ES untuk Sibalau; dan 1,1727±0,019 % b/b ES untuk Sisanggan.Hasil analisis SPSS menunjukkan terdapat perbedaan kadar fitosterol yang bermakna pada varietas Sipenyangat, Simandam, Sibalau, dan Sisanggan (a < 0,05).