Eceng gondok(Eichornia crassipes Solms.) adalah tanaman yang hidup di perairan. Bagian daun dari tanaman ini memiliki zat aktif berupa tanin, saponin, flavonoid, fenol, antrakuinon, terpenoid dan steroid. Penelitian ini bertujuan menganalisis perbedaanaktivitas daya hambatoptimum ekstrak daun eceng gondok terhadap Escherichia colidan Salmonella typhi secara in vitro. Rancangan penelitian ini menggunakan true experimental, post test-only with control group design, terdiri dari 10 perlakuan ekstrak daun eceng gondok (10 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml, 600 mg/ml, 700 mg/ml, 800 mg/ml, 900 mg/ml) dan ciprofloxacin 5 µg (kontrol positif). Analisis data penelitian menggunakan uji  one-way ANOVA, uji post-hoc Duncan, dan independent t-test dengan tingkat kepercayaan 95%.Hasil penelitian didapatkan perbedaan daya hambat optimum dari semua perlakuan dan peningkatan daya hambat sesuai dengan peningkatan konsentrasi. Ekstrak daun eceng gondok 800 mg/ml merupakan konsentrasi optimum terhadap Escherichia coli(25,37 mm) sedangkan terhadap Salmonella typhi (23,32 mm) konsentrasi optimum terdapat diantara 700 mg/ml – 800 mg/ml.Simpulan penelitian ini yaitu terdapat perbedaandaya hambatoptimum dari sediaan ekstrak daun eceng gondok terhadap Escherichia colidan Salmonella typhi.