Pepaya (Carica papaya L.) merupakan salah satu tanaman yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat di seluruh dunia. Biji pepaya memiliki kandungan zat aktif sebagai antibakteri seperti flavonoid, alkaloid dan saponin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan aktivitas daya hambat ekstrak biji pepaya terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Streptococcus pyogenes ATCC 19615 pada konsentrasi optimum secara in vitro. Rancangan penelitian ini adalah true experimental dengan post test-only with control group design yang terdiri dari sepuluh perlakuan konsentrasi, kontrol positif (penisilin). Analisis data penelitian menggunakan uji One-way Anova, uji post hoc Duncan, dan uji T independent dengan tingkat kepercayaan 95%. Terdapat perbedaan daya hambat yang bermakna dari semua perlakuan, dan terdapat peningkatan efek daya hambat sesuai dengan peningkatan konsentrasi. Perlakuan konsentrasi 80% merupakan konsentrasi yang optimum terhadap Staphylococcus aureus (20,35 mm) dan perlakuan konsentrasi 70% merupakan konsentrasi yang optimum terhadap Streptococcus pyogenes (21,57 mm). Ekstrak biji pepaya memiliki aktivitas daya hambat yang lebih besar terhadap bakteri Streptococcus pyogenes dibandingkan dengan Staphylococcus aureus.
Kata-kata kunci: antibakteri, biji pepaya, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes