Produksi buah pepaya (Carica papaya L.) di Indonesia cenderung meningkat setiap tahun. Bagian buah pepaya yang dikonsumsi adalah dagingnya, sedangkan bijinya dibuang sebagai limbah. Biji pepaya diketahui mengandung senyawa-senyawa antibakteri seperti flavonoid, alkaloid dan saponin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan aktivitas daya hambat ekstrak biji pepaya terhadap Escherichia coli ATCC 25922 dan Shigella dysenteriae ATCC 13313 pada konsentrasi optimum secara in vitro. Rancangan penelitian ini adalah true experimental dengan post test-only with control group design yang terdiri dari sepuluh perlakuan konsentrasi dan kontrol positif (siprofloksasin). Analisis data penelitian menggunakan uji One-way Anova, uji post hoc Duncan, dan uji T independent dengan tingkat kepercayaan 95%. Hasil penelitian menunjukkan perbedaan daya hambat yang bermakna dari semua perlakuan, dan terdapat peningkatan efek daya hambat sesuai dengan peningkatan konsentrasi. Ekstrak biji pepaya menghambat secara optimum pada konsentrasi 75% terhadap Escherichia coli (26,34 mm) dan Shigella dysenteriae (17,71 mm). Simpulan dari penelitian ini adalah ekstrak biji pepaya memiliki aktivitas daya hambat yang lebih besar terhadap Escherichia coli dibandingkan Shigella dysenteriae.
Kata-kata kunci: daya hambat, ekstrak biji pepaya, Escherichia coli, Shigella dysenteriae