Infeksi Staphylococcus aureus sering dikaitkan sebagai penyebab utama nosokomial. Bakteri ini mampu membentuk biofilm yang tahan terhadap zat disinfeksi, sehingga penting mengevaluasi bahan disienfeksi serta menemukan disinfektan alternatif. Citrus hystrix DC (C.hystrix) pada sediaan kombinasi diketahui mengandung berbagai senyawa antibakteri yang berpotensi sebagai antibiofilm. Penelitian ini bertujuan menganalisis daya hambat kombinasi ekstrak daun dan kulit buah Citrus hystrix (KEDK C. hystrix) terhadap penghambatan biofilm Staphylococcus aureus ATCC 25923, berdasarkan parameter Mean Gray Value (MGV) dan Minimum Biofilm Inhibitory Concentration (MBIC). Rancangan penelitian menggunakan true experimental posttest only control group design. Metode uji tabung digunakan pada perlakuan KEDK C. hystrix konsentrasi 6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 75%, dan 100% serta kontrol etanol 96%. Analisis data menggunakan Uji One-way Anova dan Post Hoc Duncan. Hasil penelitian memperlihatkan rerata MGV tertinggi dihasilkan KEDK C. hystrix 100%, KEDK C. hystrix 75% tidak berbeda bermakna dengan etanol 96%. Nilai MBIC KEDK C. hystrix terdapat pada konsentrasi 12,5%. Simpulan penelitian, kombinasi ekstrak daun dan kulit C.hystrix menghasilkan daya hambat terhadap pembentukan biofilm S. aureus.