Keterampilan berpikir kritis merupakan  bagian dari keterampilan abad ke-21 yang dapat dilatih dengan e-modul, namun keterbatasan e-modul biologi yang dirancang khusus untuk melatih keterampilan berpikir kritis masih belum dikembangkan secara merata. Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan e-modul biologi yang layak untuk melatih keterampilan berpikir kritis  peserta didik ditinjau berdasarkan validitas, kepraktisan, dan keefektifan. Jenis penelitian ini merupakan educational design reseacrh menggunakan model Tessmer meliputi evaluasi diri, uji pakar, uji perorangan, uji kelompok kecil, dan uji lapangan. Subjek penelitian yang digunakan terdiri atas 3 pakar untuk menguji validitas e-modul biologi, 3 peserta didik untuk uji perorangan, 10 peserta didik untuk uji kelompok kecil, dan 30 peserta didik untuk uji lapangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa e-modul biologi hasil pengembangan dinyatakan sangat valid dengan nilai 95,4 berdasarkan hasil validasi ahli, e-modul biologi dinyatakan praktis karena hasil uji daya tarik, keterlaksanaan dan respon peserta didik pada uji kelompok kecil dan uji lapangan dikategorikan sangat baik, e-modul biologi termasuk dinyatakan efektif karena hasil keterampilan berpikir kritis peserta didik mendapat nilai rata N-Gain sebesar 0,5 dengan kriteria sedang. Berdasarkan hasil tersebut, e-modul biologi hasil pengembangan dinyatakan layak digunakan untuk melatihkan keterampilan berpikir kritis peserta didik.