Luka kaki diabetes merupakan komplikasi yang sering terjadi pada pasien diabetes melitus. E. coli merupakan salah satu flora normal yang dapat menjadi patogen pada luka tersebut. Salah satu pengobatan topikal untuk luka kaki diabetes ialah hidrogel. Madu kelulut dapat diberikan sebagai alternatif antibakteri karena kandungan gula dan keasaman yang tinggi, hidrogen peroksida, flavonoid, tanin, alkaloid, dan peptida antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat aktivitas antibakteri yang berbeda pada hidrogel madu kelulut (Heterotrigona itama) konsentrasi 20% dan 25% serta perlakuan kontrol terhadap E. coli ATCC 25922 berdasarkan diameter zona hambat. Penelitian ini menggunakan metode true experimental dengan rancangan posttest only with control group design. Perlakuan yang diujikan adalah konsentrasi 20%, 25%, dan kontrol positif yaitu Cutimed® gel serta kontrol negatif yaitu aquadest steril dengan pengulangan uji sebanyak 6 kali. Data hasil penelitian yang dilakukan uji One-way ANOVA dan Post-hoc Duncan ditemukan perbedaan secara nyata pada tiap perlakuan uji dengan p <0,05. Perlakuan konsentrasi 20% menghasilkan rerata diameter zona hambat sebesar 11,33 mm dan konsentrasi 25% sebesar 16,36 mm. Hasil penelitian ini menunjukkan terdapat aktivitas antibakteri yang berbeda pada tiap perlakuan uji terhadap E. coli dengan aktivitas antibakteri terkuat ditunjukkan oleh perlakuan konsentrasi 25%.