Ikan papuyu (Anabas testudineus Bloch 1972) merupakan salah satu komoditas perikanan bernilai ekonomi tinggi di Kalimantan Selatan, namun populasinya semakin terancam akibat tingginya tingkat eksploitasi dan rendahnya upaya budidaya. Untuk mendukung upaya konservasi, diperlukan data mengenai identitas dan tingkat keragaman genetik populasi ikan papuyu sebagai dasar dalam perumusan kebijakan pengelolaan yang tepat. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis variasi dan posisi filogenetik populasi ikan papuyu di Kalimantan Selatan berdasarkan penanda molekuler ITS serta membandingkannya dengan pengelompokan berbasis gen COI dan pendekatan morfologi. Penelitian ini menggunakan pendekatan molekuler melalui analisis variasi genetik dan filogenetik, serta pendekatan morfologi melalui analisis komponen utama. Variasi genetik pada sekuen ITS A. testudineus didominasi oleh mutasi substitusi (transisi dan transversi) dengan nilai nucleotide diversity sebesar 0,10964, menunjukkan tingkat keragaman genetik yang tinggi. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa populasi A. testudineus terbagi menjadi tiga kelompok utama: KH (Salimuran) dan KD (Karang Dukuh); TB (Lok Baintan) dan KR (Kurau); serta DP (Danau Panggang). Pengelompokkan A. testudineus berdasarkan sekuen ITS dan COI menunjukkan pola pengelompokan yang berbeda. Sedangkan hasil Principal Component Analysis (PCA) pada data morfometrik menunjukkan pola pengelompokan yang sejalan dengan hasil filogenetik berdasarkan sekuen ITS.