Pengolahan mandai merupakan salah satu kearifan lokal yang ada pada masyarakat di daerah Kalimantan Selatan. Ragam koloni jamur mikroskopis pada proses fermentasi mandai merupakan salah satu bentuk fakta atau elemen yang ada di lingkungan sehingga fakta tersebut dapat dijadikan bahan untuk mengembangkan bahan ajar biologi berbasis lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeskripsikan ragam koloni jamur pada proses fermentasi mandai, mendeskripsikan hasil uji kesesuaian, hasil uji kelayakan, hasil uji keterbacaan, dan hasil uji respon peserta didik terhadap Handout elektronik ragam koloni jamur mikroskopis pada proses fermentasi mandai. Penelitian dan pengembangan ini menggunakan model 4D oleh Thiagarajan et al. 1974 yang dilaksanakan hingga tahapan disseminate namun secara terbatas hanya pada kelas XI D T.A.  2024/2025 di SMAN Banua Kalsel. Teknik pengumpulan data dilakukan dengan menggunakan instrumen kesesuaian, kelayakan, keterbacaan, dan respon peserta didik. Subjek uji kesesuaian dan kelayakan terdiri atas 3 orang validator dan subjek untuk uji keterbacaan dan respon peserta didik terdiri atas 9 orang peserta didik kelas XI D T.A. 2024/2025 di SMAN Banua Kalsel. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Handout elektronik ragam koloni jamur mikroskopis pada proses fermentasi mandai untuk materi keanekaragaman hayati sub materi klasifikasi makhluk hidup yang dikembangkan memperoleh nilai kesesuaian 82,00% yang tergolong sangat sesuai, nilai kelayakan 86,6% yang tergolong sangat layak, nilai keterbacaan 81,6% yang tergolong sangat baik, dan nilai respon peserta didik 77,4% yang tergolong menarik. Berdasarkan pada hasil penelitian maka dapat diketahui jika Handout elektronik yang dikembangkan dapat menunjang pembelajaran pada materi keanekaragaman hayati sub materi klasifikasi makhluk hidup.