Padi (Oryza sativa L.) merupakan tanaman penghasil makanan pokok di negara Indonesia dan di Kalimantan Selatan, padi menjadi pendukung ketahanan pangan regional. Penggunaan benih unggul bermutu tinggi berpotensi menghasilkan produksi yang berkualitas salah satunya nilai gizi yang tersedia. Gen OsAUX5 memainkan peran penting dalam akumulasi asam amino esensial. Ekpsresi gen tersebut diregulasi oleh suatu sekuen upstream dari gen tersebut, yakni W-box. Tujuan dari penelitian ini yaitu isolasi dan sekuen DNA daerah regulator gen OsAUX5 padi serta merancang primer PCR untuk mendeteksi keberadan W-box pada gen OsAUX5. Metode penelitian ini meliputi penanaman benih padi, desain primer daerah regulator gen OsAUX5, isolasi DNA padi, amplifikasi dengan metode PCR, sekuensing daerah regulator, analisis hasil sekuensing, analisis motif daerah regulator, desain primer PCR untuk deteksi haplotipe W-box. Hasil penelitian ini yaitu sampel padi lokal Kalimantan Selatan siam unus merupakan padi dengan haplotipe 1 karena memiliki dua buah W-box utuh sehingga dapat mengakumulasi asam amino esensial dengan optimal. Sedangkan pada sampel Japonica, W-box kedua mengalami insersi sepanjang 18-bp. Desain primer untuk deteksi haplotipe dapat memfasilitasi pemilihan tanaman yang memiliki haplotipe unggul yang mendukung program perbanyakan dan pemuliaan tanaman. Hal ini memungkinkan pengembangan varietas padi dengan kandungan asam amino esensial yang lebih baik secara efisien dan terarah. Kesimpulan penelitian ini yaitu Siam Unus memiliki dua W-box utuh untuk akumulasi optimal asam amino esensial, primer berhasil dari sekuens regulator gen OsAUX5 untuk mendeteksi haplotipe tanaman padi.