Rizosfer merupakan daerah di sekitar perakaran tanaman yang menjadi habitat ideal bagi kehidupan mikroorganisme tanah, termasuk jamur mikroskopis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman koloni jamur mikroskopis pada tanah rizosfer tanaman mangrove serta untuk mengembangkan E-Handout sebagai bahan ajar penunjang pada mata kuliah Mikrobiologi. Penelitian dilaksanakan di Kawasan Mangrove Desa Muara Kintap, Kabupaten Tanah Laut dengan pendekatan deskriptif. Pengambilan sampel tanah dilakukan pada 3 lokasi, masing-masing diambil dari 3 titik pengambilan. Identifikasi jamur dilakukan berdasarkan morfologi koloni mengacu pada literatur. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 12 jenis koloni jamur mikroskopis yang berhasil diidentifikasi, terdapat 6 yang berbentuk filamen, 5 berbentuk bulat, dan 1 berbentuk mengkerut. E-Handout dikembangkan menggunakan model pengembangan ADDIE hingga tahap evaluasi. Hasil validasi oleh tiga orang validator menunjukkan persentase validasi materi sebesar 81,6% (valid) dan validasi media sebesar 97% (sangat valid). Uji keterbacaan oleh 9 mahasiswa menunjukkan persentase sebesar 90,4% (sangat baik), uji respon oleh 26 mahasiswa menunjukkan persentase sebesar 90,75% (sangat baik), sedangkan uji keefektifan oleh 26 mahasiswa menunjukkan keefektifan terhadap mahasiswa, diperoleh nilai rata-rata N-gain sebesar 0,85 yang termasuk dalam kategori tinggi. Berdasarkan hasil tersebut, E-Handout yang dikembangkan dinyatakan layak digunakan sebagai media pembelajaran dalam mendukung pemahaman mahasiswa mengenai keragaman jamur mikroskopis pada rizosfer tanaman mangrove.