Penyakit gugur daun karet yang disebabkan oleh cendawan Pestalotiopsis sp. merupakan kendala utama dalam produksi karet. Pengendalian patogen ini masih bergantung pada penggunaan pestisida sintetis, yang keberhasilannya belum terbukti dan dapat merusak ekosistem jika digunakan dalam jangka panjang. Oleh karena itu, pengendalian hayati menggunakan mikroorganisme antagonis menjadi alternatif yang lebih ramah lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk menguji efektivitas tiga agensia antagonis, yaitu Trichoderma harzianum, Penicillium simplicissimum, dan Bacillus cereus, dalam menghambat pertumbuhan P. microspora secara in vitro. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 perlakuan dan 6 ulangan, serta pengamatan dilakukan selama 6 hari. Parameter yang diukur adalah tingkat hambatan pertumbuhan koloni patogen. Hasil penelitian menunjukkan bahwa T. harzianum dan P. simplicissimum mampu menghambat pertumbuhan P. microspora dengan persentase penghambatan lebih dari 50%. T. harzianum memberikan hambatan tertinggi sebesar 58,49%, diikuti oleh P. simplicissimum dengan 56,47%. Sebaliknya, B. cereus tidak menunjukkan pengaruh yang signifikan terhadap pertumbuhan patogen, bahkan menunjukkan nilai negatif pada beberapa ulangan, yang mengindikasikan ketidakefektifan dalam menekan pertumbuhan P. microspora secara in vitro.