Cabai (Capsicum annuum L.) merupakan komoditas penting yang produktivitasnya sering menurun akibat penyakit layu yang disebabkan oleh cendawan Fusarium spp. Penggunaan cendawan antagonis Trichoderma spp. merupakan alternatif pengendalian yang ramah lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk menguji efektivitas beberapa isolat Trichoderma spp. asal perakaran bambu, rumput gajah, kacang tanah, dan cabai dalam menghambat pertumbuhan Fusarium spp. serta mengidentifikasi mekanisme antagonismenya secara in vitro. Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor dengan metode dual culture pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Hasil penelitian menunjukkan bahwa keempat isolat Trichoderma spp. mampu menghambat pertumbuhan Fusarium spp. dengan persentase daya hambat yang tidak berbeda nyata. Isolat Trichoderma spp. asal perakaran cabai menunjukkan daya hambat tertinggi sebesar 63,92%, diikuti oleh isolat asal rumput gajah sebesar 62,58%, bambu sebesar 62,28%, dan kacang tanah sebesar 61,31%. Mekanisme antagonis keempat isolat Trichoderma spp. adalah kompetisi, antibiosis, parasitisme, dan lisis.