Pembelajaran Mikrobiologi memerlukan bahan ajar yang mendukung pemahaman konsep secara kontekstual, salah satunya melalui pemanfaatan bahan lokal esktrak daun Ficus spp. sebagai bahan uji alami antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk (1) mendeskripsikan kemampuan ekstrak daun Ficus spp. dalam menghambat pertumbuhan Escherichia coli sebagai potensi yang digunakan dalam pengembangan e-handout, (2) menentukan nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ekstrak daun Ficus spp., terhadap pertumbuhan Escherichia coli sebagai potensi yang digunakan dalam pengembangan e-handout serta (3) mendeskripsikan kelayakan e-handout uji antimikroba daun Ficus spp. terhadap pertumbuhan Escherichia coli. Penelitian ini menggunakan metode Educational Design Research (EDR) dengan model pengembangan Plomp dan Nieveen (2013) yang dibatasi hingga tahap prototyping phase. Uji antimikroba dilakukan menggunakan metode difusi cakram, sedangkan penentuan MIC menggunakan metode dilusi semi padat. Kelayakan e-handout dinilai melalui expert review oleh dua orang ahli dan one to-one evaluation oleh lima orang mahasiswa. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 1) ekstrak daun Ficus fistulosa, Ficus rosulata, Ficus uncinata, dan Ficus variegata mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli dengan kategori daya hambat sedang hingga kuat, sedangkan Ficus montana tidak menunjukkan aktivitas antibakteri; 2) Nilai MIC belum tercapai pada rentang konsentrasi yang digunakan dan 3) E-handout yang dikembangkan dinyatakan sangat valid dengan skor 3,92 dan memiliki tingkat keterbacaan sangat baik dengan skor rata-rata sebesar 3,81. E-handout ini telah memenuhi aspek validitas dan kepraktisan secara isi, namun masih perlu dilanjutkan pada tahap selanjutnya melalui uji efektivitas untuk mengetahui dampaknya terhadap hasil belajar mahasiswa.