Bercak daun merupakan penyakit penting pada fase pembibitan kelapa sawit karena dapat menghambat pertumbuhan tanaman. Pemanfaatan mikroorganisme antagonis Trichoderma sp. dan Bacillus sp. asal tanah perakaran tanaman bambu, kelapa sawit dan rumput gajah merupakan alternatif pengendalian yang bersifat alami dalam menghambat patogen Pestalotiopsis sp. penyebabpenyakit bercak daun bibit kelapa sawit. Penelitian ini diperlukan untuk mengetahui kemampuan Trichoderma sp. dan Bacillus sp. asal tanah perakaran tanaman bambu, kelapa sawit dan rumput gajah dalam menghambat pertumbuhan Pestalotiopsis sp. penyebab penyakit bercak daun bibit kelapa sawit secara in vitro dengan mekanisme antagonismenya Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September-November 2025 yang bertempat di lahan perkebunan di Desa Sungai Riam Kabupaten Tanah Laut untuk mengambil sampel tanah perakaran tanaman. Isolasi, pemurnian, identifikasi dan uji antagonis dilakukan di Laboratorium Fitopatologi Fakultas Pertanian Universitas Lambung Mangkurat Banjarbaru.Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) 2 faktor tunggal dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan sehingga total keseluruhan berjumlah 24 cawan petri. Hasil dari penelitian terbukti semua isolat Trichoderma sp. lebih efektif menghambat pertumbuhan Pestalotiopsis sp. dibandingkan Bacillus sp. isolat Trichoderma sp. asal tanah perakaran tanaman kelapa sawit mencapai daya hambat tertinggi 73,11% (kategori tinggi), diikuti tanah perakaran rumput gajah 71,00% (tinggi), dan tanah perakaran bambu 63,89% (sedang), sedangkan ketiga isolat Bacillus sp. hanya mencapai kategori sedang dengan nilai terbaik 65,56% (tanah perakaran bambu), 59,44% (tanah perakaran rumput gajah), dan 59,22% (tanah perakaran sawit). Mekanisme Trichoderma sp. berupa kompetisi terdapat misellium Trichoderma sp. tumbuh mendesak misellium Pestalotiopsis sp., mekanisme parasitisme menunjukkan hifa Trichoderma sp. membentuk cabang-cabang berbentuk pengait di sekeliling hifa Pestalotiopsis sp., mekanisme lisis dengan terdapat adanya hifa Pestalotiopsis sp. bening dan hancur akibat hifa Trichoderma sp. dan mekanisme antibiosis ditandai dengan zona bening diantaraTrichoderma sp. dan Pestalotiopsis sp.  Mekanisme Bacillus sp. indikator kuat adanya zona bening yang jelas memisahkan koloni cendawan patogen Pestalotiopsis sp. dari koloni bakteri Bacillus sp.