Indonesia memiliki keanekaragaman hayati yang tinggi dengan potensi besar pada genus Acacia sebagai sumber flavonoid yang dipengaruhi oleh faktor lingkungan tempat tumbuh. Adanya variasi kandungan senyawa aktif ini memerlukan analisis profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) guna mengidentifikasi perbedaan komponen kimia secara visual melalui nilai Retardation factor (Rf) dan pola kromatogram. Tujuan penelitian ini adalah menentukan profil kromatografi lapis tipis (KLT) dan menetapkan kadar flavonoid total dari ekstrak etanol 96% daun A. auriculiformis dan A. mangium asal Banjarbaru dan Batola menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Hasil profil KLT menunjukkan bahwa sampel A. auriculiformis asal Banjarbaru dan Batola memiliki profil bercak yang mirip, demikian pula pada sampel A. mangium asal Banjarbaru dan Batola. Hasil analisis KLT dengan eluen etil asetat : n-heksana (8:2) menunjukkan adanya bercak dengan nilai Rf yang mendekati standar kuersetin (Rf 0,66) pada seluruh sampel. Penetapan kadar flavonoid total menunjukkan variasi yang signifikan, yaitu A. mangium Banjarbaru memiliki kadar tertinggi sebesar 10,23% b/b EK, A. auriculiformis Banjarbaru sebesar 6,8567% b/b EK, A. mangium Batola sebesar 3,8867% b/b EK, dan kadar terendah terdapat pada A. auriculiformis Batola sebesar 3,2567% b/b EK. Nilai RSD semua sampel < 2%, yang menunjukkan metode ini memiliki presisi yang baik. Terdapat perbedaan profil KLT dan kadar flavonoid total pada daun A. auriculiformis dan A. mangium berdasarkan lokasi pengambilannya. Sampel asal Banjarbaru menunjukkan kadar flavonoid dan nilai rendemen yang lebih tinggi dibandingkan sampel asal Batola. Hal ini mengindikasikan bahwa kondisi lingkungan Banjarbaru lebih mendukung biosintesis flavonoid, kemungkinan dipengaruhi oleh paparan cahaya matahari yang lebih tinggi dan kondisi tanah yang tidak tergenang air.

Kata Kunci: Acacia auriculiformis, Acacia mangium, Flavonoid, KLT, Spektrofotometri UV-Vis, Banjarbaru, Batola.