Infeksi Begomovirus pada tanaman mentimun (Cucumis sativus L.) merupakan salah satu penyakit penting yang dapat menimbulkan beragam gejala di lapangan serta menghambat pertumbuhan dan menurunkan produktivitas tanaman. Hasil survei di beberapa sentra budidaya mentimun di Kota Banjarbaru dan Kabupaten Banjar menunjukkan adanya tanaman yang memperlihatkan gejala khas infeksi Begomovirus. Keterbatasan informasi mengenai jenis virus yang berasosiasi dengan penyakit tersebut menjadi kendala dalam penyusunan strategi pengendalian yang efektif. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi gejala penyakit di lapangan sekaligus mendeteksi keberadaan Begomovirus yang menginfeksi tanaman mentimun menggunakan pendekatan molekuler. Pengambilan sampel dilakukan secara acak terhadap 20 tanaman pada setiap lokasi pengamatan, yaitu Kecamatan Guntung Payung dan Landasan Ulin Utara di Kota Banjarbaru serta Kecamatan Karang Intan dan Astambul di Kabupaten Banjar. Deteksi molekuler menggunakan primer universal Begomovirus SPG1 dan SPG2 berhasil mengamplifikasi fragmen DNA berukuran sekitar ±912 pb pada sampel daun yang menunjukkan gejala mosaik disertai vein banding. Hasil amplifikasi memperlihatkan bahwa sampel D1, D2, dan D3 menghasilkan pita DNA spesifik sesuai target, sedangkan sampel D4 tidak menunjukkan pita DNA yang jelas meskipun keberadaan Bemisia tabaci ditemukan pada lokasi pengambilan sampel. Analisis sekuens nukleotida menunjukkan bahwa isolat D1, D2, dan D3 memiliki tingkat kesamaan tertinggi dengan Tomato leaf curl New Delhi mosaic virus asal Yogyakarta, masing-masing sebesar 95,13%, 94,87%, dan 95,01%. Berdasarkan hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa Begomovirus yang berasosiasi dengan tanaman mentimun di Kota Banjarbaru dan Kabupaten Banjar, Kalimantan Selatan, memiliki hubungan kekerabatan genetik yang tinggi dengan Tomato leaf curl New Delhi mosaic virus yang sebelumnya dilaporkan menginfeksi tanaman melon di Yogyakarta.