Penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh Ralstonia solanacearum merupakan salah satu kendala utama pada tanaman hortikultura. Pemberian pestisida golongan bakterisida dapat mempengaruhi dan memberikan dampak negatif terhadap lingkungan. Alternatif pengendalian yang dapat dilakukan adalah menggunakan pengendalian hayati dengan memanfaatkan mikroorganisme golongan bakteri. Tujuan dari kajian ilmiah ini adalah mengetahui efektivitas agens hayati Pseudomonas kelompok fluorescens dan Bacillus spp. dalam menghambat pertumbuhan R. solanacearum secara in vitro. Penelitian ini menggunakan 4 isolat Pseudomonas kelompok fluorescens dan 4 isolat Bacillus spp. Berasal dari  koleksi Laboratorium Fitopatologi. Pengujian dilakukan menggunakan metode penyemprotan pada media Nutrient Agar (NA), kemudian data dianalisis menggunakan ANOVA dan dilanjutkan dengan DMRT taraf 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa seluruh isolat efektif menghambat pertumbuhan Ralstonia solanacearum dengan membentuk zona hambat. Isolat Pseudomonas kelompok fluorescens dengan kode Pf.2.Pks menunjukkan daya hambat tertinggi sebesar 18,57 mm, sedangkan isolat Bacillus spp. kode Bc.Cb.211 menunjukkan daya hambat tertinggi sebesar 25,96 mm. Penelitian ini menunjukkan bahwa Pseudomonas kelompok fluorescens dan Bacillus spp. berpotensi sebagai agen pengendalian hayati terhadap penyakit layu bakteri secara in vitro.