Latar Belakang: Actinomycetes merupakan bakteri tanah yang mengandung metabolit sekunder berupa senyawa antibiotik. Senyawa antibiotik tersebut berpotensi sebagai antibakteri alternatif terhadap mikroba rongga mulut. Salah satu mikroba rongga mulut yang memiliki peran besar dalam perkembangan karies adalah Lactobacillus acidophilus. Tujuan: Tujuan penelitian ini adalah menganalisis aktivitas antibakteri Actinomycetes terhadap pertumbuhan Lactobacillus acidophilus. Metode: Penelitian ini menggunakan 9 kelompok perlakuan, yaitu konsentrasi 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10%, 20%, 40%, K(+) klorheksidin glukonat 0,2%, dan K(-) aquades. Pengukuran aktivitas antibakteri menggunakan KHM dan KBM. Hasil: Uji hipotesis One Way ANOVA dan uji Post Hoc Dunnets T3 nilai KHM dan KBM menunjukkan p=0,000 (p<0,05). Pada konsentrasi 0,625% mampu menghambat pertumbuhan Lactobacillus acidophilus yang ditetapkan sebagai KHM dan pada konsentrasi 10% tidak ditemukan pertumbuhan Lactobacillus acidophilus yang kemudian ditetapkan sebagai KBM. Kesimpulan: Dari hasil penelitian terdapat aktivitas antibakteri Actinomycetes terhadap pertumbuhan Lactobacillus acidophilus.