Instrumen PCR komersial laboratorium memiliki keterbatasan berupa biaya pengadaan dan operasional yang tinggi, sehingga diperlukan alternatif alat rakitan mandiri yang ekonomis namun tetap presisi. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi profil suhu operasional serta penerapan metode amplifikasi DNA menggunakan sistem PCR semi-otomatis rakitan sendiri. Karakterisasi profil suhu dilakukan menggunakan sensor pendeteksi suhu eksternal pada area keliling lingkaran radial chamber selama rentang total 15 menit dimulai dari awal pengujian hingga mencapai kondisi konstan. Penerapan metode amplifikasi diuji melalui reaksi penggandaan wilayah gen Internal Transcribed Spacer (ITS) pada sampel tanaman Jeruk Limau Kuit (Citrus amblycarpa) secara duplo dan wilayah gen 16S rRNA pada isolat bakteri Escherichia coli secara quadruplicate dengan optimasi volume reaksi 25 L untuk menekan laju penguapan sampel. Hasil pengukuran fisik menunjukkan nilai simpangan baku (SD) yang sangat seragam sebesar 0,1 ? di seluruh fasa dengan nilai deviasi akurasi total sistem sebesar ±0,033 ?, menunjukkan deviasi suhu batas toleransi yang lebih kecil dari deviasi suhu alat PCR komersial yang digunakan sebagai acuan. Pengujian biologis berhasil menunjukkan visualisasi pendaran pita DNA yang spesifik pada gel elektroforesis agarose. Analisis kurva standar linear Excel untuk sampel tanaman ( = 0,9967) menghasilkan rata-rata ukuran fragmen DNA tanaman Limau Kuit sebesar 823,39±7,01 bp dengan tingkat presisi tinggi (CV 0,85%) dan galat akurasi sebesar 9,24% terhadap kontrol komersial. Sementara itu, analisis kurva standar linear untuk sampel bakteri ( = 0,9931) menghasilkan rata-rata ukuran fragmen DNA bakteri E. coli sebesar 1257,64±44,18 bp dengan nilai CV sebesar 3,51% dan galat akurasi sebesar 7,76%. Akumulasi nilai galat pengujian biologis yang secara konsisten berada di bawah ambang batas kritis 15% menegaskan bahwa alat PCR rakitan mandiri ini memiliki kesetaraan fungsional yang valid dengan mesin komersial laboratorium dan layak digunakan untuk analisis molekuler dasar.