Bioteknologi merupakan ilmu yang mengintegrasikan berbagai konsep biologi dengan perkembangan teknologi untuk menghasilkan produk dan jasa yang bermanfaat bagi kehidupan manusia. Bidang ilmu ini memiliki potensi besar untuk melatihkan keterampilan berpikir kritis mahasiswa. Bahan ajar yang digunakan masih bergantung pada buku teks standar dan powerpoint sehingga masih perlu dikembangkan khususnya berbasis keterampilan berpikir kritis. Penelitian ini merupakan penelitian pengembangan dengan pendekatan educational design research (EDR) yang bertujuan untuk mengevaluasi kevalidan, kepraktisan, dan keefektifan Buku Ajar hasil pengembangan dalam melatih keterampilan berpikir kritis mahasiswa. Jenis penelitian menggunakan desain evaluasi formatif Tessmer yang terdiri dari evaluasi diri, validasi ahli, uji perorangan, uji kelompok kecil, dan uji lapangan. Penelitian dilakukan di Pendidikan Biologi Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin (ULM). Subjek penelitian pada uji ahli terdiri dari 3 dosen Magister Pendidikan Biologi ULM, uji perorangan 3 mahasiswa, uji kelompok kecil 12 mahasiswa, dan uji lapangan 17 mahasiswa S1 Pendidikan Biologi ULM pengikut mata kuliah Pengantar Bioteknologi. Hasil penelitian menunjukkan validitas termasuk kategori sangat valid dengan rerata 88,69%. Kepraktisan isi terkategori sangat baik dengan rerata 87,82%. Keterlaksanaan (harapan; 86,11% dan aktual; 87,11%) terkategori sangat baik dan respon mahasiswa (harapan; 89,10% dan aktual; 90,05%) terkategori sangat baik. Peningkatan keterampilan berpikir kritis ditunjukkan oleh nilai rerata N-Gain harapan dan aktual terkategori sedang (harapan; 0,53 dan aktual; 0,59. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa Buku Ajar dinyatakan valid, praktis, dan efektif untuk melatih keterampilan berpikir kritis mahasiswa.