Pembelajaran pada mata kuliah Mikrobiologi masih menghadapi kendala berupa keterbatasan bahan ajar yang menyajikan visualisasi morfologi dan karakteristik jamur mikroskopis secara kontekstual. Salah satu potensi lingkungan lokal yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber belajar adalah rizosfer Melaleuca cajuputi di Kabupaten Barito Kuala yang memiliki keragaman jamur mikroskopis. Penelitian ini bertujuan untuk mendeskripsikan karakteristik jamur mikroskopis pada rizosfer Melaleuca cajuputi, mengembangkan E-Handout berbasis keragaman jamur mikroskopis, serta mendeskripsikan hasil validitas dan keterbacaan E-Handout sebagai bahan pengayaan mata kuliah Mikrobiologi. Penelitian ini merupakan penelitian Educational Design Research (EDR) dengan model Plomp & Nieveen. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 18 biakan mikroba diperoleh 10 koloni jamur mikroskopis yang memiliki karakteristik morfologi beragam berdasarkan bentuk koloni, warna, tekstur permukaan, dan tepi koloni. Hasil eksplorasi jamur mikroskopis tersebut digunakan sebagai dasar pengembangan E-Handout. Hasil validasi menunjukkan bahwa E-Handout sangat valid dengan persentase sebesar 97,6%, dan hasil uji keterbacaan menunjukkan kategori sangat baik dengan persentase sebesar 94,7%. E-Handout jamur mikroskopis pada rizosfer Melaleuca cajuputi dinyatakan valid dan memiliki keterbacaan yang sangat baik sehingga dapat digunakan sebagai bahan pengayaan pada mata kuliah Mikrobiologi.