Latar Belakang: Senyawa antibakteri umumnya banyak dihasilkan dari bahan herbal, namun antibakteri juga dapat dihasilkan dari mikroba tanah salah satunya ialah bakteri Actinomycetes, Actinomycetes merupakan bakteri tanah yang mampu menghasilkan metabolit sekunder berupa senyawa antibakteri. Senyawa antibakteri tersebut memiliki potensi sebagai agen antibakteri alternatif terhadap mikroba rongga mulut. Salah satu mikroba rongga mulut yang memiliki peran besar terhadap terjadinya karies adalah Streptococcus mutans. Tujuan: Tujuan penelitian ini adalah menganalisis aktivitas antibakteri Actinomycetes terhadap pertumbuhan Streptococcus mutans. Metode: Penelitian ini menggunakan 9 kelompok perlakuan, yaitu konsentrasi 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10%, 20%, 40%, klorheksidin glukonat 0,12% sebagai kontrol (+) , dan aquades sebagai kontrol (-). Pengukuran aktivitas antibakteri dilakukan dengan cara melihat KHM dan KBM. Hasil: Uji hipotesis One Way ANOVA dan uji Post Hoc Dunnets T3 nilai KHM dan KBM menunjukkan p=0,000 (p<0,05). Didapatkan konsentrasi 0,625% mampu menghambat pertumbuhan Streptococcus mutans yang ditetapkan sebagai KHM dan pada konsentrasi 40% tidak ditemukan pertumbuhan Streptococcus mutans yang kemudian ditetapkan sebagai KBM. Kesimpulan: Dari hasil penelitian terdapat aktivitas antibakteri Actinomycetes terhadap pertumbuhan Streptococcus mutans.