Autentikasi spesies berbasis molekuler memerlukan metode identifikasi akurat untuk mendukung pengawasan keamanan pangan. DNA barcoding menggunakan gen Cytochrome c Oxidase Subunit I (COI) banyak digunakan karena akurat, termasuk pada sampel non-invasif. Penelitian ini bertujuan memperoleh DNA berkualitas dari feses dan buccal swab Rattus norvegicus, mengevaluasi amplifikasi gen COI melalui optimasi suhu annealing PCR, serta mengidentifikasi spesies berdasarkan sekuens COI, sehingga dapat menjadi dasar pembelajaran dan model awal pengembangan metode identifikasi molekuler. Penelitian eksperimental ini meliputi ekstraksi DNA metode presipitasi dan CTAB, amplifikasi PCR, elektroforesis, sekuensing Sanger dua arah, pembentukan consensus sequence, analisis BLAST, multiple sequence alignment, dan rekonstruksi pohon filogenetik (Maximum Likelihood, Kimura 2-Parameter). Amplifikasi COI menghasilkan pita spesifik pada seluruh sampel. Sekuensing menghasilkan tiga sekuens konsensus karena dua sampel penangkaran Rumah Boni (feses dan buccal swab), dari individu sama, digabung. BLAST mengidentifikasi sampel Rumah Boni sebagai Rattus norvegicus (identity 99,08%), sedangkan sampel Laboratorium Farmasi dan rumah peneliti teridentifikasi sebagai Rattus sp. (99,60% dan 99,02%). Alignment kedua sampel Rattus sp. menunjukkan lima mutasi transisi (C↔T), dan filogenetik menempatkan keduanya satu klad (bootstrap 100) berdekatan dengan Rattus tiomanicus dan Rattus baluensis. Metode non-invasif terbukti dapat digunakan untuk identifikasi molekuler Rattus norvegicus.