Danau Rawoijo diduga sebagai tempat manusia prasejarah dalam mencari makanan sehari-hari. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis perbandingan morfologi dan kekerabatan ikan puyau asal Danau Rawoijo dan asal Kabupaten Banjar berdasarkan profil protein. Perbandingan morfologi dilakukan dengan mengamati morfologi dan mengukur secara morfometrik serta meristik, penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry, analisis profil protein dilakukan dengan metode SDS-PAGE dan analisis hubungan kekerabatan dengan metode UPGMA. Berdasarkan hasil penelitian didapatkan perbedaan morfologi ikan puyau asal Danau Rawoijo dan asal Kabupaten Banjar. Kadar protein optimum yang didapatkan dengan metode Lowry berturut-turut yaitu 68,93; 116,08; 6,72;7,96; dan 4 sampel asal Kabupaten Banjar berturut-turut 19,17;16,93;20,04; dan 20,04 mg/mL. Berdasarkan hasil SDS-PAGE didapatkan 20 profil protein atau variasi bobot molekul protein yang ditemukan dari 64 band hasil analisis profil protein dengan metode SDS-PAGE pada 8 (delapan) sampel ikan puyau.  Jenis protein yang ditemukan diduga Protein Aktin, Carbonic Anhydrase, Trypsin Inhibitor, β-lactalbumin, dan Lysozyme. Hasil analisis UPGMA memiliki kecenderungan mengelompokkan 2 kluster yang berkerabat antara ikan puyau asal Danau Rawoijo dan Kabupaten Banjar.