Limau kuit merupakan jeruk lokal Kalimantan Selatan. Kulit dari buah limau kuit memiliki kandungan minyak atsiri yang berpotensi sebagai antibakteri. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan aktivitas antibakteri minyak atsiri kulit buah limau kuit terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923, menentukan nilai konsentrasi hambat minimum, dan mengidentifikasi senyawa yang terkandung dalam minyak atsiri kulit buah limau kuit. Minyak atsiri kulit buah limau kuit diperoleh dari distilasi uap-air. Analisis GC-MS dilakukan untuk menentukan senyawa utama dari minyak atsiri kulit buah limau kuit dan senyawa yang aktif sebagai antibakteri. Hasil penelitian menujukkan bahwa uji aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 menunjukkan minyak atsiri dapat menghambat pertumbuhan bakteri pada konsentrasi 100%, 75%, 50%, dan 25% dengan konsentrasi hambat minimum 25% untuk sampel basah dan kering. Minyak atsiri kulit buah limau kuit memiliki 15 senyawa untuk sampel basah dan 16 senyawa untuk perlakuan kering dengan 5 senyawa utama yaitu limonena, γ-terpinena, β-pinena, α-pinena, dan sabinena. Senyawa yang besifat sebagai antibakteri diantaranya adalah limonena, α-pinena, β-pinena, γ-terpinena, α-terpineol, sabinena, dan terpinen-4-ol.