DNA barcoding dalam pemanfaatannya melibatkan analisis segmen spesifik dari gen Cytochrome C Oxydase Subunit I (COI) yang ditemukan di dalam genom mitokondria, dan digunakan secara luas untuk kajian identifikasi spesies dan biodiversitas. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi ikan papuyu (Anabas testudineus) berdasarkan gen COI. Spesimen ikan diperoleh dari lima lokasi berbeda di wilayah Kalimantan Selatan yaitu Candi Laras, Danau Panggang, Sungai Tabuk, Kurau, dan Batakan. Setelah dilakukan analisis morfologi, sampel sirip pada masing-masing spesimen dilakukan penggerusan untuk proses ekstraksi DNA. Ukuran gen COI pada ikan papuyu antara 666 bp hingga 689 bp. Identitas gen COI dari ikan papuyu dianalisis dengan BLAST dan dikonfirmasi dengan data di BOLD System. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 10 sekuen sampel memiliki tingkat kemiripan tertinggi sebesar 98,83% hingga 99,40% dengan spesies Anabas testudineus di Genbank OM674614.1 dan 100% dikonfirmasi pada BOLD Systems. Analisis filogenetik yang dihasilkan dengan metode Maximum Likelihood (ML) menunjukkan bahwa spesies Anabas testudineus asal Kalimantan Selatan dan wilayah Indonesia lain, ditemukan sebagai kelompok yang terpisah.