Staphylococcus aureus merupakan bakteri penghasil biofilm yang menjadi penyebab tersering infeksi kulit. Secara alami antibiofilm dapat berasal dari senyawa metabolit sekunder.  Daun dan kulit kayuXylocarpus granatum  pada sediaan kombinasi diketahui mengandung berbagai senyawa antimikroba dan  berpotensi sebagai antibiofilm. Penelitian experimentalini bertujuan membuktikan pengaruh kombinasi ekstrak etanol daun dan kulit kayu (D+KK) X. granatum terhadap pembentukan biofilm S. aureus secara in vitro. Metode pengamatan menggunakan uji tabung dari perlakuan ekstrak D+KK X.grnatum 6,25%-100% dengan kontrol Ampicilin 0,5% Parameter yang dimati adalah  konsentrasi hambat biofilm minimal (KHBM) dan Mean Gray Value (MGV). Hasil pengamatan  KHBM didapat pada konsentrasi 12,5%. Hasil analisis statistik didapatkan perbedaan efek yang signifikan dari tiap perlakuan. Kenaikan konsentrasi ekstrak D+KK75%mempengaruhi penipisan cincin biofilm pada tabung. Ekstrak D+KK 100% terhadap S.aureus ATCC 25923 menghasilkan berkisar  132.1075 dan 146.6775 , dan MGV ampsilin sebesar 132.035 Kandungan fitokimia pada ekstrak D+KB X.granatum seperti flavonoid, saponin, tanin, steroid dan terpenoid berperan sebagai antibiofilm pada S.aureus. Kesimpulan, esktrak daun dan kulit kayu X.granatum berpengaruh terhadap penghambatan biofilm yang dihasilkan S.aureus. 

Kata-kata Kunci: biofilm, staphylococcus aureus, uji tabung, mean gray value,  xylocarpus granatum.