Staphylococcus aureus merupakan patogen oportunis dan memiliki kemampuan untuk membentuk biofilm. Biofilm merupakan kolonisasi bakteri yang melekat pada permukaan dan tertanam dalam matriks ekstraseluler yang memperparah resistensi terhadap antibiotik. Daun Piper betle dan Akar Fibraurea tinctoria memiliki kemampuan antibakteri terhadap S. aureus. Kandungan fitokimia pada sediaan kombinasi diketahui bersifat antibiofilm. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas kombinasi infus daun P. betle dan akar F. tinctoria sebagai antibiofilm dalam menghambat pembentukan biofilm S. aureus. Penelitian ini adalah penelitian true experimental-posttest only control group menggunakan metode tube test. Perlakuan kombinasi infus konsentrasi 6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100% dengan kontrol tetrasiklin. Parameter yang diamati adalah Mean Gray Value dan Minimum Biofilm Inhibitory Concentration. Perlakuan dilakukan 4 kali ulangan dan dianalisis secara parametrik taraf kepercayaan 95%. MBIC kombinasi infus daun P. betle dan akar F. tinctoria didapatkan pada konsentrasi 6,25%. Terdapat perbedaan bermakna pada nilai MGV. Nilai MGV tertinggi dihasilkan infus daun P. betle dan akar F. tinctoria 100%. Nilai MGV tetrasiklin tidak berbeda bermakna dengan kombinasi infus konsentrasi 50% dan 25%. Simpulan penelitian, kombinasi infus daun P. betle dan akar F. tinctoria memiliki aktivitas antibiofilm terhadap biofilm S. aureus.