Air sungai menjadi tempat pembuangan limbah domestik, rumah sakit, peternakan, dan limbah industri yang mengandung berbagai jenis bakteri dan residu antibiotik akibat penggunaannya yang kurang bijak. Salah satu jenis patogen yang resisten terhadap berbagai obat adalah E. coli penghasil Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya bakteri E. coli penghasil ESBL pada sungai di Banjarmasin. Penelitian ini menggunakan metode deskriptif observasional. 12 sampel air sungai dipilih menggunakan teknik purposive sampling dari 3 sungai yang berbeda. Jenis bakteri diidentifikasi menggunakan metode konvensional dan dilanjutkan dengan Double Disk Synergy Test untuk konfirmasi ESBL. Pada 12 isolat bakteri, ditemukan 2 isolat (16,7%) E. coli, 5 isolat (41,25%) Klebsiella sp., dan 5 isolat (41,25%) Proteus sp. Terdapat beragam resistensi antibiotik beta-laktam pada penelitian ini namun tidak ditemukan E. coli penghasil ESBL. Kesimpulan dari penelitian ini didapatkan bakteri E. coli namun tidak ditemukan E. coli penghasil ESBL pada air sungai di Banjarmasin.