Staphylococcus aureus (S.aureus) merupakan bakteri penyebab infeksi yang ditularkan melalui tangan. Penularannya dapat dicegah menggunakan antiseptik berbahan alkohol 70%, tetapi penggunaan jangka panjang dapat mengiritasi kulit. Hal ini mendasari penemuan antiseptik alternatif. Penelitian eksperimental ini bertujuan untuk menganalisis aktivitas antibakteri kombinasi infus daun Piper betle Linn (P.betle) dan Citrus hystrix (C.hystrix) terhadap S.aureus. Penelitian ini menggunakan rancangan posttest-only with control group design dengan perlakuan uji, infus kombinasi daun P.betle dan C.hystrix konsentrasi 6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100%, alkohol 70%, fenol 5%, dan akuades steril berdasarkan hasil uji koefisien fenol metode uji dilusi serta zona hambat menggunakan metode difusi. Hasil penelitian diperoleh nilai koefisien fenol >1 serta diameter zona hambat terluas pada bakteri uji diperoleh dari kombinasi infus daun P.betle dan C.hystrix konsentrasi 100% yaitu sebesar 22,24 mm yang tergolong sangat kuat dan pada konsentrasi 75% menghasilkan efek setara alkohol 70%. Berdasarkan parameter nilai koefisien fenol dan diameter zona hambat, diperoleh aktivitas antibakteri dari kombinasi infus daun P.betle dan C.hystrix terhadap S.aureus.

Kata-kata kunci: infus, daun sirih (Piper betle Linn), limau kuit (Citrus hystrix), Staphylococcus aureus