Rumput laut (Eucheuma cottoni) merupakan salah satu komoditi unggulan dalam perdagangan dunia. Permintaan pasar rumput laut  dalam dan luar negeri juga sangat besar, bahkan pada tingkat konsumsi lokal (pasar)  masih sulit bagi petani untuk memenuhinya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh substitusi tepung rumput laut (Eucheuma cottonii) pada biskuit terhadap kesukaan panelis dan nilai kadar air dan serat kasar biskuit. Rancangan yang digunakan pada penelitian ini adalahrancangan acak lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan. Parameter ujipada penelitian ini yaitu uji kadar serat kasar, uji kadar air dan uji organoleptik.Perlakuan pada penelitian ini terdiri dari perlakuan O (Substitusi 0% tepung rumput laut),perlakuan A (Substitusi 5%tepung rumput laut), perlakuan B (Substitusi 10%tepung rumput laut), dan perlakuan C (Substitusi 15%tepung rumput laut). Berdasarkan hasil uji kadar air, serat kasar dan uji organoleptik terhadap biskuit, ditemukan perlakuan A merupakan perlakuan terbaik (subsitusi 5% tepung rumput laut). Hasil uji organoleptik ditemukan kebanyakan dari para panelis lebih menyukai biskuit perlakuan A dengan nilai rata-rata spesifikasi warna 6,33 (60%) (suka), aroma 7,00 (70%) (sangat suka), tekstur 6,40 (57%) (suka), dan rasa 6,80 (67%) (sangat suka). Kandungan kadar air perlakuan A sebesar 4,65% telah memenuhi syarat yang ditetapkan dalam mutu biskuit SNI 01-2973-2022, yaitu maksimal 5%. Kandungan kadar serat kasar perlakuan A sebesar 5,06%.