Penularan infeksi oleh Escherichia coli (E.coli) dapat decegah dengan antiseptik seperti alkohol. Antiseptik alami pada bentuk sediaan kombinasi dapat menghasilkan efek antibakteri lebih kuat. Daun sirih (P.betle) dan akar kuning (F.tinctoria) memiliki kandungan bersifat antibakteri. Tujuan penelitian ini yaitu menguji efek kombinasi infus P.betle dan F.tinctoria (PB+FT) terhadap E.coli ATCC 25922. Rancangan penelitian posttest-only with control group design ini menggunakan parameter nilai koefisien fenol dan zona hambat. Perlakuan pada uji koefisien fenol yaitu PB+FT, kontrol alkohol 70%, dan fenol 5% pada serial pengenceran 1:20-1:250. Pada uji daya hambat menggunkan PB+FT menggunakan konsentrasi 6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 75%, dan 100% serta alkohol 70% dan akuades steril. Hasil perhitungan nilai reta-rata koefisien fenol dari PB+FT, diperoleh nilai >1 dan kontrol <1. Hasil uji statistik, didapatkan efek berupa rata-rata zona hambat dipengaruhi oleh konsentrasi PB+FT. Rerata zona hambat dari PB+FT75% tidak berbeda nyata dengan alkohol 70% dan PB+FT100% menghasilkan zona hambat tergolong sangat kuat. Kesimpulan, infus PB+FT menghasilkan efek yang kuat terhadap E.coli.