Karakteristik koloni mikroba merupakan materi yang ada pada mata kuliah Mikrobiologi. Penelitian ini bertujuan untuk mendeskripsikan keragaman koloni bakteri pada tanah serta untuk mengetahui validitas, keterbacaan dan respon mahasiswa terhadap e-handout keragaman koloni bakteri pada rizosfer tanaman Citrus nobilis di Agrowisata Desa Karang Bunga. Hasil keragaman koloni bakteri yang didapatkan kemudian diidentifikasi terkait sifat-sifat koloni bakteri dan dikembangkan menjadi e-handout sebagai bahan pengayaan mata kuliah Mikrobiologi. Pengembangan e-handout dilakukan dengan model ADDIE sampai pada tahap development (pengembangan). Penelitian ini dilakukan dengan pendekatan deskriptif dengan pengambilan sampel tanah pada rizosfer tanaman Citrus nobilis. Kemudian, sampel tanah dibiakkan pada medium Nutrient Agar (NA). Subjek pada uji validasi dilakukan oleh 3 orang validator, uji keterbacaan dilakukan oleh 9 mahasiswa dan uji respon mahasiswa dilakukan oleh 9 orang mahasiswa yang telah lulus mata kuliah Mikrobiologi. Berdasarkan hasil penelitian ditemukan 16 koloni bakteri yang tumbuh pada medium dengan hasil identifikasi dari morfologi masing-masing koloni yang terlihat. Pada uji validasi e-handout oleh ahli media yang dikembangkan menunjukkan e-handout sangat valid dengan persentase 100%, validasi ahli materi dinilai sangat valid dengan persentase 86,15%, uji keterbacaan dinilai sangat baik dengan persentase 87,61%, dan uji respon mahasiswa dinilai sangat baik dengan persentase 82,93%.