Pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack) merupakan tanaman herbal yang dikenal luas memiliki berbagai manfaat farmakologis, termasuk aktivitas antipiretik, antimalaria, dan sitotoksik. Meskipun demikian, data terkait keamanan fraksi air dari akar tanaman ini masih terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh pemberian fraksi air akar pasak bumi terhadap gejala klinis dan menentukan nilai LD?? pada mencit putih betina. Uji toksisitas akut dilakukan dengan metode Acute Toxic Class, menggunakan tiga kelompok mencit: kontrol (Na-CMC 0,5%), dosis 300 mg/kgBB, dan dosis 2000 mg/kgBB. Pengamatan dilakukan selama 14 hari terhadap parameter gejala klinis, kematian, dan perubahan berat badan. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa tidak terdapat kematian maupun gejala toksisitas klinis seperti piloereksi, tremor, kejang, hipersalivasi, diare, dan perubahan perilaku pada semua kelompok. Berdasarkan nilai LD50, fraksi air akar E. longifolia memiliki nilai LD?? ≥ 2000 mg/kgBB dan termasuk dalam kategori toksik ringan (kategori 5).