Staphylococcus aureus tergolong bakteri patogen yang kerap menimbulkan infeksi pada manusia, sehingga diperlukan alternatif antibakteri berbasis bahan alam yang aman dan ramah lingkungan. Mangga kasturi (Mangifera casturi Kosterm.) termasuk tanaman endemik Kalimantan Selatan yang berpotensi sebagai antibakteri alami. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui efektivitas antibakteri ekstrak daun mangga kasturi pada pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Studi ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan variasi konsentrasi ekstrak 10%, 15%, 20%, 25%, dan 30%, menggunakan kontrol positif berupa hand sanitizer cair dan kontrol negatif berupa aquades steril. Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi cakram Kirby–Bauer serta metode pengenceran guna menetapkan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) serta Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM). Data dianalisis menggunakan uji statistik nonparametrik. Ekstrak daun mangga kasturi menunjukkan efektivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dengan kecenderungan peningkatan daya hambat seiring meningkatnya konsentrasi ekstrak berdasarkan hasil penelitian ini. KHM diperoleh pada konsentrasi 12,5% dan KBM dicapai pada konsentrasi 25%. Konsentrasi 25% menunjukkan aktivitas antibakteri paling tinggi dalam rentang konsentrasi yang diuji. Pengujian nonparametrik menggunakan metode Kruskal-Wallis menghasilkan perbedaan yang siginfikan (p < 0,001), diperkuat dengan uji Mann-Whitney yang menyatakan bahwa variasi konsentrasi ekstrak terhadap daya hambat bakteri berbeda signifikan (p < 0,05). Analisis uji probit menegaskanbahwa peningkatan konsentrasi ekstrak daun mangga kasturi (Mangifera casturi Kosterm.) berbanding lurus terhadap persentase penghambatan pertumbuhan Staphylococcus aureus yakni nilai LC?? sebesar 14,015%. Berdasarkan hasil tersebut, ekstrak daun mangga kasturi berpotensi dikembangkan sebagai antibakteri alami terhadap Staphylococcus aureus.